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O reconhecimento da região promotora pela enzima RNA Polimerase II constitui um fator crucial que determina a taxa de transcrição de cada gene, o tipo de célula no qual este gene será ativo e a fase de desenvolvimento no qual ele será expresso. Nesse processo de reconhecimento, é essencial a presença dos seguintes co-fatores:
DNA Polimerase III, ATP e Histona H1;
Sub-unidades ribossomais, Fatores de transcrição e dupla fita de DNA;
Região rica em A e T, GTP e Proteínas de ligação a cauda poli A;
Região rica em G e C, fita molde e GTP;
Fatores de transcrição, ATP, e cromatina descondensada.
Genes procariontes apresentam uma estruturação típica, bastante diferenciada da estrutura dos genes eucariontes. São características típicas do gene procarionte:
freqüente estrutura policistrônica do gene e ausência de introns;
estrutura monocistrônica e presença de um terminador na porção 3' não traduzida;
ausência de regiões intra-gênicas e tamanho;
presença de uma cauda de poli-adeninas no terminal 3' e ausência de introns;
As principais funções das regiões 5' e 3' de um RNA mensageiro eucarionte são, respectivamente:
controlar o tempo de vida do RNA mensageiro na célula e interação com a RNA Polimerase;
interação com o RNA transportador e processamento dos introns;
interação com os fatores de transcrição e controle do transporte do RNA mensageiro do núcleo para o citoplasma;
conferir afinidade pela sub-unidade menor do ribossoma e controlar o tempo de vida do RNA mensageiro na célula;
remoção dos introns e controle do tempo de vida do RNA mensageiro na célula.
Trabalhando em um laboratório de biotecnologia um pesquisador isolou, a partir de células hepáticas, o gene X. Ao analisar sua estrutura, foi constatado que este gene se apresentava organizado da seguinte forma: Região regulatória; Região 5' não traduzida; Exon 1; Intron 1; Exon 2; Intron 2; Exon 3; Região 3' não traduzida e Região terminadora. Esse gene foi introduzido no genoma de uma bactéria, sob o controle de um promotor bacteriano. Com relação ao aparecimento das moléculas de RNA mensageiro, e proteína codificadas por esse gene, pode-se concluir que:
serão observados níveis de RNA mensageiro e produção da mesma proteína produzida na célula hepática;
não será observada a produção de RNA mensageiro e de proteína;
serão observados níveis de RNA mensageiro, mas não haverá a produção da mesma proteína produzida pela célula hepática;
serão observados níveis de RNA mensageiro e a produção de três pedaços separados da proteína em questão;
Interessado em estudar a tradução de um gene, um pesquisador introduziu as seguintes mutações pontuais em diferentes regiões do gene em estudo:
I - retirada de uma base na região 5' não traduzida;
II - retirada de uma base na região codificante;
III - troca do nucleotídeo A do primeiro códon ATG por uma base C.
Ao se analisar a produção da proteína em questão, os resultados esperados são, respectivamente:
tradução correta, tradução correta e tradução anormal;
não ocorrerá tradução, tradução anormal e tradução correta;
não ocorrerá tradução em nenhuma das três situações;
tradução correta, não ocorrerá tradução e tradução correta;
tradução correta, tradução anormal, não haverá tradução.
Uma das principais atividades enzimáticas atuantes durante a tradução do RNA mensageiro é desempenhada pelo complexo Peptidil transferase. Com relação à ocupação dos sítios P e A, e à presença de nucleotídeos de alta energia, esse complexo somente apresentará atividade quando:
sítio P vazio, sítio A ocupado e presença de ATP
sítio P ocupado e sítio A vazio e ausência de GTP;
sítios P e A ocupados e presença de GTP;
sítio P e A vazios e presença de GTP;
Visando o estudo da regulação do metabolismo de lactose em bactérias foi obtida uma cepa mutante na qual o gene do repressor do Operon da Lactose foi deletado. Esta cepa foi então cultivada em duas situações metabólicas distintas:
Situação 1 – presença de lactose e ausência de glicose.
Situação 2 – ausência de lactose e ausência de glicose.
Situação 3 – presença de lactose e presença de glicose.
Ao analisar a transcrição dos genes do Operon da Lactose, desta mutante, nestas três situações, pode-se constatar que ocorrerá transcrição apenas:
na situação 1;
na situação 2;
nas situações 1 e 2;
nas situações 1 e 3;
nas situações 2 e 3.
Um pesquisador interessado no estudo da regulação da expressão tecidual de um gene preparou fusões de diferentes segmentos do promotor deste gene com um gene marcador. Cinco construções foram obtidas e introduzidas no cromossoma do organismo através de transformação genética. Após a análise do padrão de expressão do gene marcador, os seguintes resultados foram obtidos:
Analisando os resultados apresentados, pode-se concluir que os elementos reguladores responsáveis pela expressão do gene em flores, folhas e caule estão localizados, respectivamente, entre as posições:
-3000 e -2000; -2000 e -1000; -1000 e -500;
-5000 e -3000; -3000 e -2000; -2000 e -1000;
2000 e -1000; -1000 e -500; -500 e -1;
-5000 e -3000; -5000 e -2000; -5000 e -1000;
-5000 e -2000; -5000 e -2000; -5000 e -500.
Dentre as estratégias de transformação genética de plantas, o sistema baseado na utilização da bactéria de solo Agrobacterium tumefaciens se destaca pela sua altaeficiência e relativa simplicidade. Na natureza esta bactéria apresenta um plasmídeo que contém todos os componentes necessários para o processo de transferência de DNA para a célula vegetal (plamídeo Ti). São essenciais para esse processo:
as bordas de repetição direta que flanqueiam o T-DNA e genes de resistência a antibióticos codificados pelo plasmídeo Ti;
os genes de virulência (genes VIR) e os genes de metabolismo de hormônios localizados na região a ser transferida;
genes de biossíntese de hormônios vegetais localizados na região a ser transferida e as proteínas de ligação a DNA codificadas por alguns dos genes de virulência;
as bordas de repetição direta que flanqueiam o T-DNA e os genes de virulência da região VIR.
São características essenciais para o desenvolvimento de um protocolo eficiente de transformação genética vegetal através do sistema Agrobacterium tumefaciens:
a existência de um sistema de regeneração eficiente para a espécie em questão, a determinação do nível de atividade dos promotores dos genes da Agrobactéria na planta a ser transformada;
o conhecimento de parte do genoma da espécie a ser transformada e a possibilidade de se obterem protoplastos da espécie em questão;
a existência de genes de resistência ao processo de infecção por Agrobacterium no genoma da espécie vegetal e a percepção de derivados da parede vegetal pela Agrobactéria;
a susceptibilidade da espécie vegetal ao processo de infecção pela Agrobactéria e a formação de lesões necróticas no explante a ser utilizado.
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